188金宝搏备用网址 > 知识产权 > 前体信使RNA剪接的结构基础,施一公研究组相继解析了5个不同状态剪接体复合物的高分辨率结构
2019-12-13
前体信使RNA剪接的结构基础,施一公研究组相继解析了5个不同状态剪接体复合物的高分辨率结构

www.188jinbaobo.com 1

2017年11月17日,清华大学生命学院、结构生物学高精尖创新中心施一公教授研究组就剪接体的结构与机理研究于《细胞》(Cell)杂志再次发表最新成果。这篇题为《酿酒酵母“催化后剪接体”的结构》(Structure of the Post-catalytic Spliceosome from Saccharomyces cerevisiae)的论文报道了酿酒酵母剪接体呈现RNA剪接反应完成后状态(定义为“P复合物”)、整体分辨率为3.6埃的三维结构,首次展示了pre-mRNA中3’剪接位点的识别状态,该结构为回答RNA剪接反应过程中pre-mRNA中的3’剪接位点如何被识别,第二步转酯反应如何发生以及成熟的mRNA如何被释放等关键问题提供了重要的结构信息。

施一公教授研究组在《科学》发表两篇论文报道剪接体的三维结构并阐述RNA剪接的分子结构基础

清华新闻网8月23日电 8月21日,清华大学生命科学学院施一公教授研究组在《科学》同时在线发表了两篇背靠背研究长文,题目分别为“3.6埃的酵母剪接体结构”和“前体信使RNA剪接的结构基础”。第一篇文章报道了通过单颗粒冷冻电子显微技术解析的酵母剪接体近原子分辨率的三维结构,第二篇文章在此结构的基础上进行了详细分析,阐述了剪接体对前体信使RNA执行剪接的基本工作机理。这在世界上首次捕获了真核细胞剪接体复合物的高分辨率空间三维结构,阐述了剪接体对前体信使RNA执行剪接的基本工作机理。该成果的完成不仅初步解答了基础生命科学领域长期以来一直备受关注的核心问题,也为进一步揭示与剪接体相关疾病的发病机理提供了坚实的基础。清华大学生命学院博士后闫创业、医学院博士研究生杭婧和万蕊雪为两篇文章的共同第一作者。施一公院士为两篇文章的通讯作者。

www.188jinbaobo.com 2

基因剪接的分子机制示意图。

细胞是生物体的基本组成单位;而基因表达是所有细胞最基础也是最核心的生命活动。在所有真核细胞中,基因表达分为三步进行,分别由RNA聚合酶 (RNA polymerase)、剪接体(Spliceosome)、和核糖体 (Ribosome)执行。第一步简称转录,即储存在遗传物质DNA序列中的遗传信息通过RNA聚合酶的作用转变成前体信使RNA;第二步简称剪接,即由多个内含子和外显子间隔形成的前体信使RNA通过剪接体的作用去除内含子、连接外显子,转变为成熟的信使RNA;第三步简称翻译,即成熟的信使RNA通过核糖体的作用转变成蛋白质,从而行使生命活动的各种功能。描述这一过程的规律被称为分子生物学的中心法则,多个诺贝尔奖围绕此发现和阐述产生。其中,RNA聚合酶的结构解析获得2006年的诺贝尔化学奖,而核糖体的结构解析获得2009年的诺贝尔化学奖。

www.188jinbaobo.com 3

www.188jinbaobo.com ,前体信使RNA剪接的结构基础,施一公研究组相继解析了5个不同状态剪接体复合物的高分辨率结构。剪接体复合物的三维结构。

剪接体是一个巨大而又复杂的动态分子机器,其结构解析的难度被普遍认为高于RNA聚合酶和核糖体;虽然经过了过去二十多年的不懈努力,全球的科学家们还没有得到一个原子分辨率的剪接体结构。剪接体由五个小核核糖核蛋白、十九号复合物、十九号复合物相关蛋白和一系列的辅助蛋白所构成,共涉及到100多个蛋白质和至少五条RNA分子。在剪接的过程中,剪接体以前体信使RNA分子为中心,按照高度精确的顺序进行逐步组装并发生大规模结构重组,使之得以完成复杂的剪接任务。剪接是真核细胞进行正常生命活动不可或缺的核心环节,因此具有重大的生物学意义。

许多人类疾病都归咎于基因的错误剪接或是针对剪接体的调控错误。人类35%的遗传紊乱是由于基因突变导致单个基因的可变剪接引起的:比如,单个剪接位点的增加或缺失可能引起α-或β-地中海贫血症;可变剪接平衡紊乱导致的某些外显子不正常表达可能导致额颞骨痴呆症。一些癌症也与剪接因子的错误调控有关。长久以来,剪接体的结构解析一直被认为是最值得期待的结构生物学研究之一。

施一公教授领导的课题组从2009年开始进入剪接体研究的核心领域,致力于剪接体及其相关复合物的结构生物学研究,并在2014年初首次报道了剪接体复合物中重要蛋白质Lsm蛋白七聚体以及其RNA结合状态下的晶体结构,这一成果被《自然》杂志收录。之后,该课题组聚焦于极富挑战性的攻坚课题:完整剪接体的结构生物学研究。终于在今年五月份取得重大突破,捕获了真核细胞剪接体复合物的高分辨率空间三维结构。这一成果是生命科学领域的重大原创性突破,标志着人类对生命过程和本质的理解往前迈进了关键一步。

在第一篇论文中,施一公教授研究组在对传统的串联亲和层析法进行改良之后,成功提取了内源性表达的酵母剪接体复合物,利用先进的冷冻电镜图像处理和三维重构方法,获得了剪接体高分辨率的三维结构。在结构中可以看出,剪接体的外形轮廓十分不对称,各个蛋白相互缠绕,形成了分子量和体积巨大的复合物。第二篇论文对剪接体的RNA组分进行了细致的结构分析,搭建了前体信使RNA被剪切、连接的原子模型,阐述了剪接反应进行的分子机制。

这一研究成果具有极为重要的意义。自1993年RNA剪接的发现被授予诺贝尔生理及医学奖以来,科学家们一直在步履维艰地探索其中的分子奥秘,期待早日揭示这个复杂过程的分子机理。剪接体近原子分辨率结构的解析不仅初步解答了这一基础生命科学领域长期以来备受关注的核心问题,又为进一步揭示与剪接体相关疾病的发病机理提供了结构基础和理论指导。

此项研究工作得到国家自然科学基金和科技部重大研究计划的资助。数据收集、处理分别依托于清华大学冷冻电镜平台和高性能计算平台,样品的质谱鉴定与上海生化所黄超兰研究组合作完成。

附:《科学》杂志两篇论文链接:

10月29日晚,第二届未来科学大奖颁奖典礼在北京举行。因“在解析真核信使RNA剪接体这一关键复合物的结构,揭示活性部位及分子层面机理的重大贡献”,清华大学副校长施一公院士获颁“生命科学奖”。

www.188jinbaobo.com 4

www.188jinbaobo.com 5

1977年,科学家们首次发现来自于腺病毒的mRNA与其对应的DNA转录模板并不能形成连续的杂交双链,而是在杂交双链的不同位置伸出了环状的DNA单链。这个重大发现表明,遗传信息从DNA传递到mRNA上并不只是通过转录,还需要pre-mRNA剪接来进一步完成“无效”遗传信息的去除与有效遗传信息的拼接。“无效”的遗传信息不具有翻译功能,被称为内含子,而可以被核糖体翻译的有效遗传信息叫做外显子,内含子被去除、外显子被连接这一过程即为RNA剪接。RNA剪接普遍存在于真核生物中,随着物种的进化,含有内含子的基因数量增加,发生RNA剪接的频率也相应增高,使得一个基因编码多个蛋白质成为可能,极大的丰富了蛋白质组的多样性,也是真核生物多样性的重要原因之一。RNA 剪接是真核生物基因表达调控的重要环节之一,负责执行这一过程的是细胞核内一个巨大且高度动态变化的分子机器——剪接体(spliceosome)。从1977年首次发现RNA剪接至本世纪初,科学家们通过免疫沉淀、基因敲除、交联质谱、建立体外剪接反应系统等研究手段,初步建立起剪接体的组装与解聚的发生过程,以及蛋白与蛋白、蛋白与核酸之间的相互作用、相互调控等复杂的RNA剪接调控网络。RNA剪接的本质是两步转酯反应,在剪接反应过程中,多种蛋白质-核酸复合物及剪接因子按照高度精确的顺序发生结合和解聚,依次形成预组装复合物U4/U6.U5 Tri-snRNP(U4/U6.U5三小核核糖核蛋白复合物)以及至少7个状态的剪接体B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS复合物(图1)。

闪光灯中,身穿礼服的施一公登上舞台,发表获奖感言。2017年对于施一公来说,是不寻常的一年:他正好50岁,人过半百知天命;亲爱的父亲去世30周年;结婚25周年;回到清华工作10周年。似乎,有一根线,把他人生中的大事都串了起来。

但是由于剪接体组成蛋白、核酸种类多,分子量大,并具有多种动态结构,该领域进展一直比较缓慢,获得剪接体的高分辨率三维结构更是世界公认的难题。2015年,施一公研究组率先突破,在世界上首次报道了裂殖酵母剪接体3.6埃的高分辨率结构,首次展示了剪接体催化中心近原子分辨率的结构。这一重大研究成果对RNA剪接机理的研究产生革命性影响。自2015年第一个剪接体结构发表以后,施一公研究组相继解析了5个不同状态剪接体复合物的高分辨率结构,分别是酿酒酵母3.8埃的预组装复合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.5埃的激活状态复合物Bact complex、3.4埃的第一步催化反应后复合物C complex、4.0埃的第二步催化激活状态下的C* complex,以及3.5埃的内含子套索剪接体ILS complex的结构。这些已解析的剪接体基本覆盖了整个RNA剪接循环,从分子层面解释了剪接体如何组装,如何被激活,第一步转酯反应如何发生以及完成RNA剪接反应后的剪接体如何解聚等工作机理。但是第二步转酯反应如何被调控并发生,则需要捕获一个最为关键的剪接体状态——催化后剪接体,即P complex。

他感谢了家人。没有妻子孩子的爱和支持,不可能有今天。两个孩子平时很少有机会和爸爸在一起,因为他要么穿梭在不同的城市,要么就在实验室。施一公的母亲在郑州,已经不习惯坐飞机和火车,但她一直牵挂着自己的孩子。施一公的爷爷还有两天就106周岁了,当年施一公选择从美国回来,最支持他的人就是爷爷,“你在美国那么久,早该回来了。”

不同于上述已解析的多个状态的剪接体,P complex具有更高度的动态性与瞬时性,在正常生理状态下极难捕获。在最新发表的这篇《细胞》论文中,施一公研究组进一步探索并优化了蛋白提纯方案,通过在酿酒酵母中表达关键蛋白的失活突变体导致剪接体无法释放成熟的mRNA,从而获得了稳定的、性质良好的P complex样品。随后利用单颗粒冷冻电镜技术重构出了总体分辨率为3.6埃的高分辨率冷冻电镜结构,并搭建了原子模型(图2)。这一结构首次展示了RNA剪接两步转酯反应完成后剪接体的整体结构以及内部蛋白质、核酸组分的组装情况,其中可以清晰的看到原本被内含子隔开的两个外显子已经共价连接形成成熟的mRNA并且被U5 snRNA识别固定在剪接体的反应中心。值得一提的是,在这个结构中,第一次观察到了pre-mRNA中3’剪接位点AG被分支点A和5’剪接位点的第一个核苷酸G通过非经典的碱基互补配对共同识别的机制,这两个核苷酸AG还进一步被5’剪接位点的G和U6 snRNA通过碱基堆积力固定。因此,该结构的解析,首次展示了3’剪接位点被识别、关键蛋白Prp22参与成熟的mRNA释放等重要的结构信息,为领域内对第二步转酯反应发生时3’剪接位点如何被识别的长达数年的猜想与争论提供了最有效的结构证据。

他感谢了清华大学,“这些成绩都是在清华大学做出来的。”他清晰而又准确地说出了课题组里每一个人的名字,感谢他们的付出。刚回国时,他还有点担心是否能建起一支有战斗力的团队,后来发现是他多虑了。即使在条件最艰苦的时候,这个团队总是斗志昂扬。

清华大学施一公教授研究组一直致力于捕捉RNA剪接过程中处于不同动态变化的剪接体结构,从而从分子层面阐释RNA剪接的工作机理。截至目前为止,施一公研究组在酵母中一共解析了7个不同状态的剪接体高分辨的三维结构(如图3),从预组装到被激活,从发生两步转酯反应到剪接体的解聚,这7个状态的剪接体基本覆盖了整个剪接通路,首次将剪接体介导RNA剪接的过程串联起来,为理解RNA剪接的分子机理提供了最清晰、最全面的结构信息。由于对RNA剪接领域做出的重要贡献,施一公教授于不久前获得了未来科学大奖生命科学奖。

他不仅感谢了普林斯顿大学的老师和同事,还感谢了小学中学的老师。“像我这样一个从小在河南驻马店长大的孩子,9岁时的愿望是每天可以吃一个苹果,能够有一天成为一名科学家,因为一路走来都有人在为我鼓劲。”

清华大学生命学院、结构生物学高精尖创新中心施一公教授为本文的通讯作者;清华大学生命学院三年级博士研究生白蕊、生命学院博士后、结构生物学高精尖创新中心卓越学者闫创业以及医学院五年级博士研究生万蕊雪为该文的共同第一作者;清华大学冷冻电镜平台的雷建林博士为冷冻电镜数据收集提供了帮助。电镜数据采集于清华大学冷冻电镜平台,计算工作得到清华大学高性能计算平台、国家蛋白质设施实验技术中心(北京)的支持。本工作获得了北京结构生物学高精尖创新中心及国家自然科学基金委的经费支持。

最后,他特别感谢了这个大时代,让这代人有追求梦想的机遇。我国实行改革开放以后,有500多万人出国留学,已经回来的达300多万人。“作为其中的一员,我也很想在这个大时代中再多尽一份自己的力量。所以我会对自己说,我会尽全力在清华大学培养人才,帮助清华大学在生命学科往前再跨一大步。”

www.188jinbaobo.com 6

科学委员会评价道,“生命科学奖”获奖者施一公在解析真核信使RNA剪接体这一关键复合物的结构,揭示活性部位及分子层面机理作出重大贡献。分子生物学的中心法则是:遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质。从酵母到人等所有真核生物的基因含有外显子和内含子,前者是编码蛋白质的DNA序列,后者不含蛋白质编码信息。DNA指导下转录出前体信息RNA后,剪接体将内含子切除,这样得到成熟的信使RNA,后者通过翻译将遗传信息传到其编码的蛋白质的氨基酸序列中。RNA剪接的异常可以导致多种人类疾病。但是,在施一公的研究之前,剪接体的近原子分辨率结构没有得到阐明。

应用近年取得技术突破的冷冻电镜、结合前人对剪接体生物化学和结构生物学研究,施一公首先解析了真核剪接体近原子分辨率的结果,第一个揭示了活性部位,很大地推进了我们对剪接体复合物的理解。继此,施一公解析了剪接过程剪接体三个重要中间过渡复合物的结构,显示剪接体功能重要的重构和结构基础。施一公实验室还报道了人类剪接体的原子分辨率结构。结合德国马普生物物理化学研究所的Reinhard Lührmann博士和英国分子生物学实验室的Kiyoshi Nagai博士等科学家的贡献,施一公实验室的结构推动我们对剪接过程的机理理解,为治疗剪接体相关的人类疾病提供了结构框架。

未来科学大奖成立于2016年,是由企业家和科学家联合发起创办的民间科学奖项,每年评选一次,旨在奖励在大中华地区做出的原创性科学成果,从而激发社会对科学的热爱、对科学家的尊重,提升公民科学素养。清华大学教授薛其坤院士获得首届未来科学大奖的“物质科学奖”。